本期《袁來如此》為系列文章《大分子生物分析概論》的第七篇，將重點就已發(fā)表的文獻資料對抗體的總濃度和游離濃度的定量分析及其在藥代動力學中的應用進行初步的介紹。
由于內容篇幅較長，本文將采取上下篇形式進行推送，敬請垂注！《袁來如此》專欄系廣州博濟醫(yī)藥微信公眾號打造的科普學術專欄，內容均為博濟醫(yī)藥子公司深圳博瑞副總經理袁智博士原創(chuàng)。
支持用于藥物開發(fā)的生物分析的主要驅動力是數(shù)據的預期應用。配體結合式測試方法（LBA）被廣泛用于蛋白質生物藥和靶標配體（target ligands，L）的分析，以支持藥代動力學/藥效學（PK/PD）和安全性評估。特別是對于以非共價鍵結合其靶標配體的單克隆抗體藥物（mAb），體內可以存在多種形式的mAb與其靶標配體，包括游離的mAb，游離的L以及mAb和L的一價和/或二價復合物（mono- and/or bivalent complexes of mAb and L）。
考慮到給藥后體內發(fā)生的動態(tài)結合平衡的復雜性以及在生物分析過程中該平衡受到多種來源的擾動，對待測物的不同形態(tài)（游離、結合或總體mAb和L）以間接體內形式（ex vivo）進行定量分析得出的結果，可能與體內（in vivo）的實際情況不同。原則上，可以設計LBA試劑和測試格式，用于測定mAb和L的總濃度或游離濃度。
本文主要關注mAb生物藥與血液循環(huán)中以可溶形式分泌出來的，或從膜受體上脫落的靶標配體和L。本文從理論和實踐上研究了如何測定的總體/游離的待測物濃度，以提升科學界的相關認知，并提供了相關生物分析策略，以便在藥物開發(fā)的特定階段提供所需的PK/PD的信息。
基于靶向藥理機制的生物藥已經成為了當前頗具前景的藥物開發(fā)方式。生物藥主要由單克隆抗體（mAb）藥物組成，很多個mAb已經FDA批準作為藥物上市使用，預計未來將有更多相關藥物獲得進入市場。
定量測定血液循環(huán)中的mAb及其靶標配體（L）的可靠分析方法對于評估m(xù)Ab的暴露量-響應關系、支持其有效性和安全性評價、治療劑量的選擇是至關重要的。配體結合測定法（LBA）通常用于定量分析mAb及其相關L的濃度，在生物體內環(huán)境中存在多種形式的mAb和L，包括游離mAb、游離L和 mAb和L的一價和/或二價復合物。當L是二聚體或多聚體時，則會產生額外的復雜性，可以設計LBA試劑和分析格式來進行測量，包括mAb及其L的結合及游離形態(tài)。這其中，確定LBA方法所測量的確切形態(tài)至關重要。
由于LBA的數(shù)據是用于評估藥代動力學/藥效學(PK/PD)關系，因此，為了適當評估PK/PD，使用相關的分析方法清楚地闡明mAb和L的相互作用是非常重要的。本文描述如下相關共識
(1) 有關mAb和L的信息在不同的藥物開發(fā)階段的用途；(3)對生物分析的挑戰(zhàn)和相關警示（method caveats）；(4)生物分析數(shù)據對藥物開發(fā)決策的影響。同時，本文為選擇mAb和L的總體和游離濃度的測定方法提供了一個實用的策略，將從以下方面闡述:
1. 提高藥物開發(fā)界對特定的LBA方法測定mAb和L的各種形式（游離，結合，或總體/free, bound, or total)的重要性的認識。2. 介紹常見的生物分析策略及其局限性，以及這些分析方法在藥物開發(fā)的各個階段所面臨的挑戰(zhàn)。3. 識別并彌補數(shù)據提供者（生物分析科學家）和數(shù)據最終用戶（藥代動力學家、毒理學家和PK/PD建模人員）之間潛在的溝通不暢，在定義對數(shù)據的需求和理解內在的權衡和風險時。生物體液中游離、部分游離（partially free，也稱為部分結合/ partially bound），結合（bound）全部（total）mAb和L的術語。對于mAb，將其“游離/free”部分實用性地定義為表現(xiàn)出與其未結合形式（unbound forms）相等同的生物活性的形式。由于mAbs的二價性，游離mAb既包括未結合（unbound）mAb，也包括部分結合mAbs（即一價結合的/monovalently bound），這些形式通常是使用未結合的參考標準物（unbound reference standards）來定量的。總體mAb將是完全結合形式（fully bound）、部分結合形式（partially bound）和非結合形式（unbound）的總和。
除了與mAb結合外，L還可以與其它蛋白質結合，并且L上可能有多個結合位點，具有或不具有協(xié)同效應。為了簡化討論，本文將不討論L的多價結合（multivalent binding）和與近端蛋白（proximal protein）結合。在此，本文簡化了靶標配體，L，的定量，只包括“游離”(非結合，Lfree)和總體(包括與mAb結合和非結合的形式，Ltotal)；相應的參考標準物由特定的方法來確定。
雖然本文提供了一些文獻中的案例研究和例子，但目的不是要包羅萬象。為了避免文章冗長，不會詳細討論表1中的例子，只作為參考文獻列出。有興趣的讀者可參閱相關文獻。
生物分析戰(zhàn)略的主要驅動力是使用這些數(shù)據為藥物開發(fā)進行決策參考。取決于決策所需要的信息，在藥物開發(fā)的不同階段所需的數(shù)據以及因此所選擇的定量方法（游離，全部，或兩者都要）可能不同。
在藥物開發(fā)的早期階段，特定的試劑可能無法用于開發(fā)游離的mAb或L的分析方法。因此，生物分析科學家和數(shù)據使用者應了解并就下列問題進行交流:
(1)生物分析數(shù)據的預期用途；
(2)血液循環(huán)中mAb和L之間的動態(tài)平衡關系；
(3)分析方法的技術性挑戰(zhàn)（technical challenges）及其實際局限性（practical limitations）。
表1. 有關生物體液和分析類型（Assay Types）中的待測物形式的術語
在臨床前開發(fā)階段, 血清mAb的濃度用于建立非臨床物種中的PK行為，并預測首次人體給藥（FIH）時的起始劑量 (表2)。靶標配體L的濃度用于評估m(xù)Ab與L的動態(tài)平衡關系，以幫助確定具有生物活性的mAb濃度，并用于PK建模，從而確定給藥劑量和方案。
臨床階段的數(shù)據則用于描述人體藥代動力學特征，定義PK/PD與安全性和有效性的關系，并在目標患者人群中建立PK/PD模型，以支持藥物的批準上市和使用以及藥品標簽。詳細的PK/PD數(shù)據的應用列于表2和表3。
表2.臨床前開發(fā)階段藥物和靶標濃度數(shù)據的用途
在許多情況下，生物藥的藥理效應是由游離的mAb和mAbfree所決定的。如果mAb與可溶性配體結合，以防止其與同源受體結合（或通過其傳遞信號）。如果能夠在游離靶標配體與Lfree的結合與臨床響應之間建立起相關性，與L的結合和捕獲就可以作為PK/PD建模和給藥方案選擇時一個直接的生物標志物。雖然 mAbfree反映了mAb在體內的游離狀態(tài)和結合能力，但評估m(xù)Abtotal可以進一步幫助描述mAb與L之間的動態(tài)相互作用。mAb/L的比值與其動態(tài)平衡（dynamic equilibrium）高度影響生物分析方法的特異性。因此，了解藥物開發(fā)不同階段所需的信息是十分重要。
表3.臨床開發(fā)階段藥物和靶標配體濃度數(shù)據的用途
藥代動力學家通常對mAbfree頗為敏感，因為mAbfree的水平反映了可利用的活性藥物。當然，毒理學家也對mAbtotal非常敏感，因為mAb的靶向或脫靶效應（on- or off-target effects）可能帶來安全隱患。因此，在使用這些數(shù)據之前，藥代動力學家和毒理學家必須了解具體的生物分析方法是什么，并決定是否需要進行額外的分析。
就此而言，如果在藥物開發(fā)的后期改變了定量分析方法，那么可能需要重新評估PK或PD模型，因為這些模型是基于特定的定量分析方法產生藥物濃度-時間行為。從游離或結合的mAb的分析方法的角度，有綜述分析了21個FDA已批準上市的mAb藥物的LBA方法。這些報告大多沒有具體說明分析方法的格式，因此不同分析方法產生的PK參數(shù)可能不一致。
由此來看，在制定mAb的生物分析策略時，重要的是與不同功能團隊中的關鍵利益攸關方合作。包括藥物開發(fā)項目所處的階段，何時以及如何測定每個藥物開發(fā)項目中的mAb和L。
3.結合平衡總和/自由物分析方法的挑戰(zhàn)質量作用定律支配著mAb和L的結合。
該定律首先是由Guldberg和Waage于1864年提出，并被廣泛用于描述可逆性結合的相互作用（reversible binding interactions）：從steroid hormones與其結合蛋白，到mAb和L的可逆性結合。一般選擇對靶標配體（L）的有高結合親和力（binding affinity）的mAb作為藥物來開發(fā)，平衡解離常數(shù)(equilibrium dissociation constants，Kd)通常在幾個nM到pM的濃度范圍。結合動力學一般是非線性的、容量有限的（capacity limited），其結合符合二級動力學特征（second-order association）。
其中，Kd和Ka分別為平衡解離常數(shù)和結合常數(shù)。
質量作用定律可用于計算或預測平衡中各組分的濃度。Le Chatelier原理也描述了平衡隨濃度變化而移動的趨勢。圖1表明，mAb結合到L的部分（fraction of mAb bound to L），除取決于Kd外，還取決于mAb和L的濃度比值。
圖1. 在一定的mAb/L摩爾比范圍內，mAb-L親和力對 mAbfree的影響。將L的濃度固定為常數(shù)，用于模擬計算 mAbfree。為了便于解釋，本例中的摩爾比是基于假設每摩爾藥物有一個結合位點；對于mAb，每摩爾藥物有兩個結合位點。
圖1. 在一定的mAb/L摩爾比范圍內，mAb-L親和力對 mAbfree的影響。將L的濃度固定為常數(shù)，用于模擬計算 mAbfree。為了便于解釋，本例中的摩爾比是基于假設每摩爾藥物有一個結合位點；對于mAb，每摩爾藥物有兩個結合位點。
在給藥后，一般假定mAb與可溶性L的結合遵循質量作用定律。因此，可以定量分析血漿或血清樣本中mAb和L的濃度，以闡明PK/PD關系的動態(tài)平衡。如在《藥物和靶點生物分析數(shù)據的應用》章節(jié)中所討論的，根據質量作用定律的預測，mAb或L的體內平衡將以依賴于PK動力學和L的響應動力學的方式，向游離或結合狀態(tài)移動，如表4所示的情況分類。高比例的mAb/L的第一種情況是高劑量的mAb與L具有高結合親和性，這是藥物開發(fā)中經常遇到的情況。 但在某些情況下，L可能會累積并在某些時間點導致mAb/L比值降低。Lfree和/或Ltotal的增加可能在給藥后伴隨L的積累而發(fā)生，并可能抵消抑制L的預期效果，或可能帶來其他安全問題。
表4.給藥方案和體內平衡對mAb和L的影響
除了考慮給藥后mAb-L結合的體內動力學外，離體狀況（ex vivo conditions）如樣品采集、儲存、運輸和樣本分析等可能使樣本的平衡狀態(tài)與體內（in vivo）狀態(tài)大不相同。表5列出了一些可能影響結合或解離平衡動力學的狀況。
在樣品采集和分析過程中，由于平衡可能受到擾動，不同mAb和/或L的相關形式（游離的、結合的、總L和mAb）的離體定量可能會偏離體內的實際值。此外，偏差的程度取決于研究過程中樣本采集的時間，因此，很難預測由這樣的實驗確定的PK/PD行為與體內的真實狀況的相似程度。
表5.導致mAb和L的平衡轉移的離體狀況
在含有這些不同形式的混合物的樣本中，而且當很難控制mAb和/或L的特定形式的平衡動力學時，將平衡驅動到主要以mAb和L的游離或結合(總體)的形式存在，然后進行定量分析的價值較大。此外，使用分離步驟來分離游離的和結合的形式，并定量特定的形式，以獲得藥物開發(fā)的每個階段所需的PK或PD信息。許多LBA檢測平臺和條件都足夠靈活，可以完成這項工作。
本文后續(xù)將分別在《抗體藥物的定量生物分析方法》和《靶標配體的生物分析方法》章節(jié)中，討論針對mAb和L的具體形式的多種定量方法。敬請垂注！
特別聲明
本文如有疏漏和誤讀相關指南和數(shù)據的地方，請讀者評論和指正。所有引用的原始信息和資料均來自已經發(fā)表學術期刊, 官方網絡報道, 等公開渠道, 不涉及任何保密信息。參考文獻的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價值的文獻及其評估。 擴展閱讀
1. Lee JW, et al. Bioanalytical approaches to quantify “total” and “free” therapeutic antibodies and their targets: technical challenges and PK/PD applications over the course of drug development. AAPS J. 2011;13(1):99–110.2. Wang W, et al. Monoclonal antibody pharmacokinetics and pharmacodynamics. Clin Pharmacol Ther. 2008;84(5):548–58.3. DeSilva B, et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 2003;20(11):1885–900.4. Lee JW, et al. Fit-for-purpose method development and validation for successful biomarker measurement. Pharm Res. 2006;23(2):312–28.5. Betts AM, et al. The application of target information and preclinical pharmacokinetic/pharmacodynamic modeling in predicting clinical doses of a Dickkopf-1 antibody for osteoporosis. J Pharma-col Exp Ther. 2010;333(1):2–13.6. Kuang B, et al. Therapeutic monoclonal antibody concentration monitoring: free or total? Bioanalysis. 2010;2(6):1125–40.7. Baulieu EE. Some aspects of the mechanism of action of steroid hormones. Mol Cell Biochem. 1975;7(3):157–74.8. Reverberi R, Reverberi L. Factors affecting the antigen-antibody reaction. Blood Transfus. 2007;5(4):227–40.9. Lobo ED, Hansen RJ, Balthasar JP. Antibody pharmacokinetics and pharmacodynamics. J Pharm Sci. 2004;93(11):2645–68.10. Salimi-Moosavi H, et al. Novel approaches using alkaline or acid/guanidine treatment to eliminate therapeutic antibody interference in the measurement of total target ligand. J Pharm Biomed Anal. 2010;51:1128–33.11. Ezan E, Dubois M, Becher F. Bioanalysis of recombinant proteins and antibodies by mass spectrometry. Analyst.2009;134(5):825–34.12. Dubois M, et al. Immunopurification and mass spectrometric quantification of the active form of a chimeric therapeutic antibody in human serum. Anal Chem. 2008;80(5):1737–45.13. Hagman C, et al. Absolute quantification of monoclonal antibodies in biofluids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal Chem. 2008;80(4):1290–6.14. Heudi O, et al. Towards absolute quantification of therapeutic monoclonal antibody in serum by LC-MS/MS using isotope-labeled antibody standard and protein cleavage isotope dilution mass spectrome-try. Anal Chem. 2008;80(11):4200–7.15. Luna LG, et al. Ultra performance liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry for the absolute quantification of proteins and peptides. Anal Chem. 2008;80(8):2688–93.16. Wang KY, et al. Multiplexed immunoassay: quantitation and profiling of serum biomarkers using magnetic nanoprobes and MALDI-TOF MS. Anal Chem. 2008;80(16):6159–67.17. Lowe PJ, et al. Relationship between omalizumab pharmacokinetics, IgE pharmacodynam-ics and symptoms in patients with severe persistent allergic (IgE-mediated) asthma. Br J Clin Pharmacol. 2009;68(1):61–76.18. Lachmann HJ, et al. In vivo regulation of interleukin 1beta in patients with cryopyrin-associated periodic syndromes. J Exp Med. 2009;206(5):1029–36.19. Hormbrey E, et al. A critical review of vascular endothelial growth factor (VEGF) analysis in eripheral blood: is the current literature meaningful? Clin Exp Metastasis. 2002;19(8):651–63.20. Beum PV, et al. Three new assays forrituximab based on its immunological activity or antigenic properties: analyses of sera and plasmas of RTX-treated patients with chronic lymphocytic leukemia and other B cell lymphomas. J Immunol Meth. 2004;289(1–2):97–109.21. Beer PM, et al. Vitreous levels of unbound bevacizumab and unbound vascular endothelial growth factor in two patients. Retina.2006;26(8):871–6.22. Blasco H, et al. Evaluation of a peptide ELISA for the detection of rituximab in serum. J Immunol Meth. 2007;325(1–2):127–39.23. Ceze N, et al. An enzyme-linked immunosorbent assay for therapeutic drug monitoring of cetuximab. Ther Drug Monit. 2009;31(5):597–601.24. Davis RA, et al. A novel method for quantitative measurement of a biomarker in the presence of a therapeutic monoclonal antibody directed against the biomarker. J Pharm Biomed Anal. 2008;48(3):897–901.25. Li H, et al. Development of a method for the sensitive and quantitative determination of hepcidin in human serum using LC-MS/MS. J Pharmacol Toxicol Meth. 2009;59(3):171–80.26. Wang R, et al. The profile of soluble amyloid beta protein in cultured cell media. Detection and quantification of amyloid beta protein and variants by immunopre-cipitation-mass spectrometry. J Biol Chem. 1996;271(50):31894–902.
